Bessel beam plane illumination microscopy zeigt 3-D-Strukturen von lebenden Zellen

Ein neues Mikroskop erfunden von Wissenschaftler am Howard Hughes Medical Institute Janelia Farm Research Campus lassen, nutzen die Forscher ein exquisit dünnen Licht-ähnlich wie im Supermarkt-bar-code-Scanner — peer in einzelnen lebenden Zellen, wodurch die drei-dimensionalen Formen der zellulären Sehenswürdigkeiten in noch nie da gewesenen detail. Die Mikroskopie-Bilder in hoher Geschwindigkeit, so die Forscher können erstellen Sie beeindruckende Filme zu machen, dass biologische Prozesse, wie Zellteilung, lebendig.

Die Technik, die sogenannten Bessel-Strahl plane illumination microscopy, beschrieben ist wissenschaftlicher Artikel online veröffentlicht am 4. März 2011, in der Zeitschrift Nature Methods.

Ein wichtiges Ziel des Biologen ist es, zu verstehen, die Regeln, die Kontrolle molekularer Prozesse im inneren einer Zelle. Wenn man versucht zu lernen, die Regeln des Spiels, es ist besser, ein Film von Menschen, die das Spiel als es noch Fotos – und das gleiche gilt für die Zellen, sagt Janelia Farm group leader Eric Betzig. Er wurde für die Erfindung und Verbesserung der Mikroskope seit mehr als 30 Jahren. Trotz gesehen zu haben riesige Fortschritte in der Mikroskopie während dieser Zeit, Betzig sagt, das Feld ist immer noch behindert durch die Tatsache, dass viele Mikroskopie-Techniken erfordern, dass die Zellen getötet werden und fixiert in der position für die Bildgebung. Es gibt nur so viel kann man lernen, von den Toten Zellen – das entspricht immer noch Fotos, sagt er.

Betzig wollte ein Mikroskop, würden die Forscher die dynamische innere Leben der lebenden Zellen. Der Begriff Studium der lebenden Zellen, genarbte mit fluoreszenzmarkierter Proteine und andere Moleküle, ist nicht neu. Aber live-cell-Techniken können problematisch sein, weil Licht von mikroskopen kann zu Schäden an der Zelle über die Zeit. Neben der Beschädigung der Zellen, Licht bewirkt, dass die fluoreszierenden Moleküle, von denen es nur so viele-zu wink hin über die Zeit. In anderen Worten, je länger Sie studieren, die Zelle zu entdecken, seine Eigenschaften, die mehr Schaden Sie tun, um die Zelle und desto wahrscheinlicher werden Sie zu verbringen Sie Ihre „photon budget“, sagt Betzig.

Was mehr ist, wird das Licht von einem Mikroskop macht mehr der Probe als nur den kleinen Teil, der sich im Fokus. Die Beleuchtung der out-of-Fokus-Regionen erzeugt Unschärfe, die kleine intrazelluläre Funktionen erscheinen wie verlängert blobs eher als Scharfer Punkt. „Die Frage war, gibt es eine Möglichkeit, minimieren die Menge der Schäden, die Sie tun, so dass Sie dann studieren von Zellen in einer physiologischen Art und Weise, während auch die Untersuchung in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung für eine lange Zeit?“ Betzig sagt.

Lange vor der Ankunft am Janelia Farm in 2006, Betzig begann zu denken, über Möglichkeiten zur Verbesserung der live-cell-Mikroskopie. Er legte diese Gedanken zu halten, während er konzentriert sich auf das entwerfen von neuen Mikroskopie-Techniken, die schließlich zerbrechen die Grenzen der räumlichen Auflösung (verhängt durch die Gesetze der Beugung). Bis vor kurzem, mikroskopen sehen konnte, keine Objekte, die kleiner als 200 Nanometer in der Größe. Vor einigen Jahren, Betzig und seine Janelia Farm Kollege Harald Hess erfunden photoactivated localization Mikroskopie, (PALM, die produzieren können Bilder von Objekten, die nur 10-20 Nanometer in der Größe.

PALM und die meisten anderen Mikroskope – auch diejenigen, die college-Studenten verwenden in Ihrem Biologie-Kurs-Arbeit, indem man die Probe durch ein Objektiv und dann sammeln Sie das Licht, das zurück durch das gleiche Objektiv. Dieser Ansatz bewirkt, dass Licht, um Beschädigung der Probe und führt zu Unschärfe, die es schwierig machen, beobachten Sie lebende Zellen.

Im Jahr 2008, Betzig begann die Arbeit an Möglichkeiten, um diese Herausforderungen zu überwinden. Eine Idee, die er hatte, war der Einsatz von plane illumination microscopy. Der erste Vorschlag vor etwa 100 Jahren, plane illumination beinhaltet, scheint ein Blatt von Licht durch die Seite des sample lieber als die Spitze. Um das zu tun, microscopists mit zwei verschiedenen objektiven Objektive, die senkrecht zu einer anderen. „Da kommst du von der Seite, plane illumination Grenzen der Erregung viel näher an dem Teil an, der im focus“, sagt Betzig.

Obwohl auch andere Forscher, einschließlich Janelia Farm Fellow Philipp Keller, verwendet haben, plane illumination, um große Wirkung zu studieren, vielzellige Organismen, die Hunderte Mikrometer in der Größe, das Licht, die Blätter waren immer noch zu dick um effektiv zu arbeiten, für die Bildgebung innerhalb der einzelnen Zellen, die nur zehn Mikrometer in der Größe. Das Hauptproblem ist, dass die Breite Schneise des Lichts verwendet in-plane-Beleuchtung ausgesetzt mehr von der Zelle als Betzig Gruppe wollte. Dies verursacht übermäßige Unschärfe und Licht Toxizität. Um dieses problem zu umgehen, seine Gruppe verwendet ein Bessel-Strahl, der eine Besondere Art von non-Variationen Lichtstrahl, der studierte Physiker, der in den späten 1980er-Jahren und heute verwendet werden in Anwendungen, einschließlich bar-code-Scannern in Supermärkten. Fegen Sie den Strahl über die Probe schafft ein dünneres leichtes Blatt, seine Gruppe gefunden.

Bessel-Strahlen Verhalten sich ein wenig seltsam, aber, und das ist, was gehalten hat Betzig ist Postdoc-Forscher – Thomas Planchon und Liang Gao beschäftigt und in den letzten Jahren. Obwohl Sie produzieren einen sehr schmalen Lichtstrahl, Bessel-Strahlen schaffen auch etwas schwächere Licht, das die Flanken der Brennpunkt, so dass die Muster der Beleuchtung, die Aussehen wie ein bull ‚ s eye. Die extra leichte Lappen sind ein Hindernis, weil Sie erregen zu viel von der Probe. Zum Ausgleich für dieses problem, Betzig Gruppe zwei tricks. Das erste ist ein Konzept, das als strukturierte Beleuchtung, wo anstelle der pauschal den Strahl kontinuierlich, Sie drehte ihn ein-und ausschalten schnell, wie Schießen mit einem Maschinengewehr. Dies schafft einen periodischen Gitter der Erregung, die verwendet werden können, um out-of-focus blur. (Strukturierte Beleuchtung, verwendet Janelia Farm Group Leader Mats Gustafsson, ist auch ein Weg zu einer super-Auflösung).

Eine andere Strategie Betzig Gruppe verwendet, ist die zwei-Photonen-Mikroskopie, eine gängige Methode in den Neurowissenschaften, zu visualisieren, dicken Stücken von Gehirngewebe. Einer der Vorteile der zwei-Photonen-mikroskopen ist, dass sehr wenig Fluoreszenz-signal erzeugt wird aus der schwach exponierten Regionen. So, wenn Sie angewendet zwei-Photonen-Methoden, den hintergrund von der Bessel-side lobes war beseitigt, und alles was blieb war das Licht aus den schmalen zentralen Teil der Bessel-Strahl.

Sie legte dann Bild so schnell wie möglich. Der Bessel-Strahl fegt schnell durch die Probe, so dass die Gruppe fast 200 Bilder/Sekunde und den Bau von drei-dimensionalen Stapel aus Hunderten von zwei-dimensionalen Bilder in ein bis 10 Sekunden. Wie Sie gehofft hatten, fanden Sie, dass Sie nehmen könnte Hunderte von solchen drei-dimensionales Bild setzt ohne Schädigung der Zelle, Erzeugung von erstaunlichen Filme von zellulären Prozessen wie Mitose, wo die Chromosomen teilen wie eine Zelle wird zwei. „Es gibt keine andere Technik, die kommt nah an imaging so lange mit derart hohen räumlichen und zeitlichen detail“, sagt Betzig.

Letzten Sommer, sobald Sie Ihre erste live-cell von Bildern, Betzig, Planchon und Gao packten das neue instrument in einem gemieteten sport utility vehicle und brachte es dem Woods Hole Marine Biological Laboratory in Massachusetts für ein Physiologie-Kurs, in dem Sie arbeitete mit co-Autoren Jim und Cathy Galbraith von den Nationalen Instituten der Gesundheit. „Wir haben eine Menge darüber gelernt, was funktioniert und was nicht und Wege zur Behandlung der Zellen in einer Weise, die hält Ihren physiologischen Zustand, während wir tun, den imaging“, sagt er. „Wie jedes Mikroskop, die Instrumentierung ist nur ein Teil des Puzzles. Viel es ist, die richtigen samples und der richtigen Vorbereitung Methoden, damit es funktioniert.“

Das neue Mikroskop ist auch spannend, weil es verwendet werden kann in der Zukunft zu verbessern, super-resolution-Mikroskopie. PALM und andere super-resolution-Techniken beschränkt sind, suchen an dünnen, abgestorbenen Proben, und können sehr schädlich sein, wenn man am Leben haben. „Das ist, was ist wirklich toll über die Bessel – können wir uns darauf beschränken, Anregung und wirklich anfangen zu denken, über das anwenden von super-resolution-Mikroskopie zur Untersuchung der Struktur und Dynamik in dickere Zellen“, sagt Betzig. Auch ohne super-resolution -, Bessel-Strahl-plane-illumination-Mikroskopie wird ein leistungsfähiges Werkzeug für zellbiologen, Betzig sagt, da es nichtinvasiven Bilder die sich rasch entwickelnden dreidimensionalen Komplexität der Zellen.

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